Klíčová slova: "receptory, hypersenzitivní reakce, geny odolnost, signální dráhy, rezistence"
Matušinsky, P.
Úvod
Na rozdíl od živočichů nemohou rostliny před nepříznivými vlivy uniknout a musí tedy být schopné účinné adaptace. U rostlin můžeme pozorovat celou řadu obranných mechanismů. Tyto mechanismy slouží jako obranný val proti širokému spektru škodlivých činitelů a také k rozpoznání invazních organismů a jejich následné eliminaci. Pro rostlinu je nezbytné zabránit invazním organismům průniku přes pokožku jednotlivých orgánů do vnitřního prostředí. Obrana proti napadení může být jak pasivní tak aktivní (Freeman a Beattie, 2008). Pasivní ochrana je tvořená zejména bariérami jako je kutikula nebo lignifikovaná pletiva. Může být ale také chemická, založená na obsahu sekundárních metabolitů jako jsou například alkaloidy nebo fenolické látky. Aktivní obrana sestává z celé řady složitých mechanismů, kdy po rozpoznání patogenu rostlina aktivuje signální dráhy, které spustí celou kaskádu obranných opatření. Mezi tyto opatření řadíme například syntézu látek, jako jsou aktivní formy kyslíku, fytoalexiny a proteiny PR (pathogenesis related proteins). Jednou s forem obrany je tzv. hypersenzitivní reakce, kdy usmrcením buněk v okolí invaze patogenem dojede k jeho oddělení od živých tkání, což je však účinné pouze proti biotrofním patogenům (Bagirova, 2007). Vzhledem k šíři problematiky tento text shrnuje pouze malou část znalostí o interakci mezi hostitelem a patogenem. Mnoho pracovišť na různých místech světa se zabývá studiem vztahů rostlin a jejich parazitů na molekulární úrovni a průběžně jsou přinášeny nové poznatky.
Pasivní obranné mechanismy
Jedná se o tzv. pre-infekční vrozené bariéry, které jsou přítomny po celou dobu života rostliny a to i v případě, kdy k žádnému napadení patogenem nedojde. Dělíme je na strukturní a chemické.
Strukturní bariéry
Tyto pasivní morfologické bariéry omezují nebo úplně zabraňují průniku patogenu do rostlinných pletiv. Povrch rostlin je tvořen kutikulou, přičemž jejími hlavními složkami jsou kutin, celulóza, suberin a pektiny. Tyto vrstvy vytváří jakousi bariéru proti patogenním mikroorganizmům (Serrano a kol. 2014). Další funkční překážku proti patogenům tvoří buněčná stěna, která může být zesílena ligninem. Mezi další struktury patří např. trichomy, které chrání rostlinu zejména proti okusu herbivory.
Chemické bariéry
Jsou to rostlinami produkované sloučeniny, někdy označované jako sekundární metabolity, které v širším pojetí nejsou nezbytné pro základní životní funkce, ale jejich biosyntéza navazuje na primární metabolismus. Termín „sekundární“ se s rozšiřováním poznatků jeví stále více jako nepřesný. Jejich význam je mimo jiné právě v obranných procesech rostlin uplatňovaných proti škodlivým činitelům. Do této široké skupiny látek a komponovaných sloučenin patří např. alkaloidy, flavonoidy, saponiny nebo terpeny (Wink, 1988). Jak již bylo uvedeno, tyto látky se vyskytují v rostlině nezávisle na tom, zda dojde či nedojde k napadení. Některé z nich jsou však pro samotnou rostlinu toxické, proto jsou uloženy ve vakuolách, ve formě prekurzorů a jsou aktivovány po napadení škodlivým činitelem. Důležitou součástí mnoha rostlin jsou vonné látky, tzv. silice. Jsou silně aromatické a v rostlinách jsou lokalizovány většinou v žláznatých trichomech nebo siličných kanálcích. Mohou prostupovat všechna pletiva jako u jehličnanů nebo se koncentrují do kůry, květů či semen. Plní v rostlinách převážně ochranou funkci, většinou proti hmyzu, ale i proti napadení bakteriemi či houbami (Matušinsky a kol. 2016). Z chemického hlediska se skládají z komplexních směsí monoterpenů, fenolů, diterpenů a sesquiterpenů zastoupených v různých poměrech. V praktické ochraně rostlin se využívají látky, které byly inspirovány právě některými sekundárními metabolity. Asi nejznámějším příkladem využití v zemědělské praxi jsou insekticidy s obsahem syntetických pyretroidů. Předlohou pro jejich přípravu byly pyrethriny původem z kopretiny (Pyrethrum sp.). Do skupiny látek s funkcí chránit rostlinu proti napadení patří i saponiny hojně rozšířené sekundární metabolity s velkou strukturní a funkční rozmanitostí. Řadí se do rozsáhlé skupiny glykosidů a skládají se z hydrofobního aglykonu a z hydrofilní, sacharidové složky. Kombinace hydrofobní a hydrofilní složky činí ze saponinů molekuly snižující povrchové napětí, schopné tvořit pěnu a emulze. Saponiny se vyskytují u celé řady rostlin, např. prvosenky, břečťanu, bramboříku, zlatobýlu a některých jednoděložných rostlin. Vzhledem k jejich antimikrobním, antiparazitickým a insekticidním vlastnostem se předpokládá jejich praktické uplatnění v ochraně rostlin proti chorobám a škůdcům (Matušinsky, 2017).
Aktivní obrana
Aktivní obrana se spouští v případě, že je rozpoznán patogen. Podle současného stavu poznání předpokládáme, že k rozpoznání patogenu je rostlina vybavena receptory schopnými rozpoznat tzv. MAMPs (microbe-associated molecular patterns), tedy evolučně vysoce konzervované struktury a molekuly vyskytující se u všech typů patogenních ale i nepatogenních mikroorganizmů (Newman a kol., 2013). Mezi intenzivně studované MAMPs patří flagelin (složka bičíků bakterií), elongační faktor EF-Tu, chitin (složka stěn hub), lipopolysacharidy, peptidoglykany či β-glukany. Odpověď rostliny na tyto MAMPs je známá jako MTI (MAMPs-triggered imunity tj. imunita spuštěná MAMPs). Zdá se tedy, že klíčovými strukturami jsou právě ony receptory, které dokáží rozpoznat přítomnost patogenu. Tyto receptory označované také jako PRRs (pattern recogniton reeptors) mají většinou podobnou strukturní stavbu tvořenou extracelulárně lokalizovanými na leucin bohatými repeticemi LRR (leucine rich repeats) a kinázovou doménou v cytoplazmatické části. Po rozpoznání molekul patogenu receptory PRR je aktivována signální kaskáda zahrnující MAP kinázy (mitogen-activated protein kinase), která vede u hostitele k přeprogramování genové exprese zahrnující aktivaci genů s antimikrobiální funkcí. Během evoluce docházelo k souběžnému vývoji jak na straně rostlin, tak samozřejmě také na straně patogenů. Patogeny jsou schopny překonat tyto uvedené mechanismy různými strategiemi, např. uvolňují do hostitelských buněk tzv. efektory, což jsou obecně látky, které umožňují v určité fázi procesu rozpoznání či přenosu signálu z receptoru na transkripční faktor tento proces vypnout a utlumit tak obranou reakci rostliny. Ani rostliny nezůstávají pozadu a opět si v průběhu evoluce vyvinuly mechanismy, kterými jsou schopny rozpoznat efektorové molekuly patogenu a reagovat na ně velmi razantní specifickou odpovědí. Tento mechanismus pak nazýváme efektorem spouštěná imunita ETI (effector-triggered imunity).
Rostliny jsou rezistentní vůči většině potenciálně patogenních organismů. V takovém případě hovoříme o tzv. nehostitelské rezistenci, kdy mikroorganismus není schopen překonat preformované bariéry, nebo je hned v počátku rozpoznán a potlačen. U typu rezistence, kterou označujeme jako hostitelská, jsou popsány dva typy: rasově specifická a rasově nespecifická. Rasově nespecifická resistence má kvantitativní charakter a je založena na souběžném účinku několika minor genů, tedy genů malého účinku, někdy označovaných jako kvantitativní lokusy. Typickým rysem tohoto typu rezistence je, že choroba není zcela eliminována, ale její projev je mírný s pomalejším průběhem nebo nižší intenzitou sporulace patogenu. Tento typ rezistence má trvalejší charakter, protože je pro populace patogenu obtížné jej překonat. Dalším znakem je vliv prostředí, který má na úroveň kvantitativní rezistence významný vliv. Z hlediska šlechtitelů je tvorba odrůd s kvantitativním typem rezistence náročnější, nežli je tomu u rezistence kvalitativní. Rasově specifická rezistence je charakterizována kvalitativním projevem a je pravděpodobně založena na vztahu „gen proti genu“ (Flor, 1971). Podle této hypotézy existuje ke každému genu rezistence hostitele korespondující gen avirulence v genomu patogenu. Pokud se setká rostlina nesoucí gen rezistence s patogenem nesoucím příslušný gen avirulence, dojde k inkompatibilní interakci, patogen je rozpoznán a spuštěním obranných mechanizmů je eliminován. Ve všech ostatních případech, kdy v interakci chybí jeden či oba korespondující geny, dojde k rozvoji onemocnění. Takovou interakci pak označujeme jako kompatibilní. Produktem genu rezistence může být právě receptor, který je specifický k produktu genu avirulence patogenu, jímž může být nízkomolekulární látka, bílkovina nebo oligosacharid obvykle nazývaná obecným pojmem elicitor. Rezistence založena na majorgenu (gen velkého účinku) je sice velmi účinná, často však dochází k jejímu překonání novými rasami patogenů. Mnoho v současnosti pěstovaných odrůd nese nějaké majorgeny rezistence k chorobám, jelikož je pro šlechtitele relativně snadné s takovýmto typem dědičnosti ve šlechtitelských programech pracovat. Navíc jsou dostupné moderní metody založené na molekulárních markérech, které mohou významně usnadnit identifikaci jedinců nesoucích žádoucí gen. Jak již bylo uvedeno výše, tento typ kvalitativní rezistence bývá obvykle dříve či později překonán novou rasou patogenu a z toho důvodu se šlechtitelé pokouší o tzv. pyramidování genů, tedy vytvoření odrůdy, která v sobě nese několik genů odolnosti současně.
Hypersenzitivní reakce
Jak již bylo uvedeno výše, hostitelská rostlina po rozpoznání patogenu aktivuje celou řadu obranných mechanismů, které podle rychlosti můžeme rozdělit do dvou skupin: rychlé a pomalé. Rychlé spočívají v aktivaci již existujících složek a jsou lokalizovány v povrchových vrstvách. Při rychlé odpovědi dochází např. k depolarizaci membrán, syntéze aktivních forem kyslíku a oxidů dusíku či otevření iontových kanálů. Může docházet také k tzv. hypersenzitivní reakci, kdy zahubením vlastního pletiva v místě ataku dojde k zamezení dalšího šíření patogenu. Hypersenzitivní reakce je formou programované buněčné smrti, která je pod genetickou kontrolou buněk. Při hledání signálu indukujícího hypersenzitivní reakce bylo zjištěno, že je produkován peroxid vodíku a superoxid a dochází k tzv. oxidačnímu vzplanutí.
Obr. 1 Nekrotické skvrny na listech ječmene vyvolané obligátně biotrofním patogenem Blumeria graminis f. sp. hordei. Přítomnost patogenu není na listech pouhým okem viditelná, skvrny jsou vyvolané hypersenzitivní reakcí na přítomnost spor B. graminis.
Hypersenzitivní reakce je vysoce regulovaný proces, který zahrnuje oddělení protoplastu od buněčné stěny, čímž dochází k přerušení spojení sousedních buněk plasmodezmaty. Dále dochází k aktivaci proteáz a nukleáz, aktivaci Ca2+ transportu přes plasmatickou membránu, štěpení DNA na fragmenty, peroxidaci membránových lipidů, rozložení chloroplastů, degradaci makromolekul např. proteinů atd. Pomalé mechanismy obrany jsou charakterizovány změnou exprese genů a jsou popsány níže v kapitole navazující na problematiku signálních drah, které jsou v celém procesu obrany klíčové.
Proteiny PR
Jedná se o stresové proteiny kdy zkratka PR z anglického názvu pathogenesis related proteins, volně přeložená do češtiny, znamená proteiny související s patogenezí. Je to skupina proteinů s antimikrobiální aktivitou, které jsou ve zvýšené míře syntetizovány po napadení patogenem. Proteiny PR tvoří velmi početnou a různorodou skupinu. V tomto přehledu se zaměříme pouze na 5 nejvýznamnějších skupin a to na PR-1 až PR-5. Každá z těchto pěti skupin je dělena na základě odlišného isoelektrického bodu na další dvě podtřídy. Kyselé antifungální proteiny se nacházejí v extracelulárním prostoru, zatímco bazické proteiny jsou přítomny v buněčných vakuolách (Heřmanová a kol. 2006). Mechanismus účinku proteinů PR-1 není znám, ovšem předpokládá se, že interagují s proteiny membránových kanálků a inhibují tak propouštění vápenatých iontů, což v konečném důsledku vede k lyzi buněk patogenu. Mechanismus účinku PR-2 proteinů spočívá v hydrolýze β-glukanů, které jsou základní složkou buněčné stěny hub což podobně jako u PR-1 proteinů vede k lyzi buněk. Obdobně jako proteiny PR-2 tak i proteiny PR-3 narušují buněčnou stěnu hub. Mechanismus účinku proteinů PR-3 je však dán jejich endochitinázovou aktivitou. Eendochitinázy narušují chitin v buněčné stěně hub s podobným destrukčním účinkem na buňku hub, jako je popsán u předešlých dvou skupin. Mechanismus účinku proteinů PR-4 podobně jako u PR-1 není dosud objasněn. Zdá se však, že proteiny PR-4 mají schopnost vázat se na β-chitin vznikající buněčné stěny a tím narušovat polaritu a růst buněk. Proteiny PR-5 vykazují vysokou podobnost primární struktury s thaumatinem a v anglickém jazyce bývají označovány jako thaumatin-like proteins. Mechanismus účinku těchto proteinů není doposud znám. Předpokládá se, že některé proteiny PR-5 způsobují změny v permeabilitě buněčných membrán u jiných byla popsána β-glukanázová aktivita nebo schopnost vázat se na β-glukan buněčných stěn hub. K výše stručně popsaným pěti skupinám rostlinných antifungálních proteinů bývají také řazeny další skupiny jako defenziny, thioniny, proteiny podobné cyklofilinu, proteiny inaktivující ribozomy, proteiny přenosu lipidů a inhibitory proteáz. Mechanismus účinků těchto proteinů nebyl dosud uspokojivě objasněn.
Fytohormony
Mezi vlastním rozpoznáním patogenu a následným spuštěním obranných mechanismů rostliny je nutné určité propojení. Komplikovaný systém, který umožňuje rostlině regulovat obranou reakci, bývá označován jako signální dráhy (Pieterse a kol., 2009). Pravděpodobně mezi nejdůležitější patří dráhy rostlinných hormonů: kyseliny salicylové, kyseliny jasmonové a etylénu. Do systému signalizace jsou zapojeny také další hormony, např. kyselina abscisová, gibereliny, cytokininy, auxiny a peptidové hormony. Kyselina salicylová má pravděpodobně v interakci mezi patogenem a hostitelem nejvýznamnější roli a to zejména při napadení biotrofními patogeny. Kyselina salicylová je v rostlinách syntetizována z isochorismátu, jehož syntéza je katalyzována isochorismát syntázou, která je u nejběžnější modelové rostliny Arabidopsis thaliana využívané mimo jiné i při intenzivním studiu interakce patogen-hostitel kódována dvěma geny ICS1 a ICS2. Do této interakce je zapojen protein NPR1 (NONEXPRESSOR OF PR GENES1), který aktivuje specifické transkripční faktory a tím přímo reguluje genovou expresi v závislosti na signálech zprostředkovaných právě kyselinou salicylovou. NPR1 je klíčový pro transkripci genů spojených s patogenezí a vyskytuje se v cytosolu rostlinné buňky jako oligomer spojený disulfidickými můstky. Při zvýšení hladiny kyseliny salicylové v buňce, dojde ke změně redoxního potenciálu a následkem toho k jeho monomerizaci. Monomer poté přechází do jádra, kde reguluje transkripci genů spojených s patogenezí.
Kyselina jasmonová hraje významnou roli v obranných procesech rostlin a to zejména ve vztahu k nekrotrofním patogenům a herbivorům. Biosyntéza kyseliny jasmonové začíná v chloroplastech, kde je kyselina α-linolenová rozštěpena fosfolipázou a následně katalyzována enzymy allenoxidsyntázou, allenoxidcyklázou a lipoxygenázou. Signální dráhu kyseliny jasmonové reguluje protein COI1 (CORONATINE INSENSITIVE 1). Jak již bylo uvedeno, kyselina jasmonová je odpovědná za regulaci obranyschopnosti proti nekrotrofním patogenům a charakterizuje ji změna exprese genů HEL (hevein like protein) a PDF1 (defenzin). Oba proteiny kódované uvedenými geny se vyznačují antifungální aktivitou. Druhá aktivita kyseliny jasmonové v obranných procesech rostlin proti herbivorům je charakterizovaná expresí genu VSP2 (VEGETATIVE STORAGE PROTEIN2). Obvykle je k regulaci exprese genů nutná součinnost několika fytohormonů. Vzájemné působení kyseliny jasmonové a etylénu ovlivňuje např. expresi defenzinů, poměrně variabilní skupiny malých proteinů s širokou antimikrobiální aktivitou.
Etylén je plynná látka zapojená do regulace celé řady fyziologických a vývojových procesů v rostlinách, včetně zrání ovoce, stárnutí nebo reakcí při poranění. Kombinace etylenu a kyseliny jasmonové je zapojena do obraných procesů proti nekrotrofním organismům, zatímco kyselina salicylová proti hemibiotrofním a biotrofním. Tyto dráhy byly v minulosti považovány za antagonistické, současné studie však ukazují, že interakce fytohormonů jsou mnohem složitější. Zvýšená odolnost k biotrofním organismům koreluje se zvýšenou citlivostí k nekrotrofním organismům a naopak (Robert-Seilaniantz et al., 2011).
Indukovaná rezistence
Indukovaná rezistence rostlin je chápána jako odolnost získaná po kontaktu se stresorem, kterým může být patogen, hebivor nebo třeba i půdní bakterie nebo mykorrhizní houba. Tato odolnost se projevuje i v částech rostliny vzdálených od místa infekce nebo poškození. Indukovaná rezistence může být vyvolána i určitými typy chemických látek jako např. kyselina salicylová, peroxid vodíku, benzothiadiazol a jiné. Dosud bylo popsáno několik typů indukované rezistence:
- lokální získaná rezistence (local acquired resistance)
- systémová získaná rezistence (systemic acquired resistance)
- indukovaná systémová rezistence (induced systemic resistance)
- systémová indukovaná rezistence (systemic induced resistance)
- mykorrhizou indukovaná rezistence (mycorrhiza-induced resistance)
Výzkum indukované rezistence má velkou perspektivu, jelikož nalezení vhodného induktoru, který by byl prakticky využitelný v ochraně rostlin, by umožnilo imunizaci rostlin proti širokému spektru škodlivých činitelů a snížení potřeby použití aplikace pesticidů.
Další mechanismy obrany
Za důležité regulátory obranných mechanismů jsou považovány post-transkripční umlčování genů pomocí malých RNA (host-induced gene silencing) a post-translační modifikace proteinů. Tyto zajímavé mechanismy budou popsány v některém z dalších příspěvků společně s podrobnějším popisem indukované rezistence.
Použitá literatura:
Bagirova, S. F. 2007. Hypersensitivity. Comprehensive and Molecular Phytopathology, Pages 247–263 doi.org/10.1016/B978-044452132-3/50013-4
Flor HH. 1971. Current status of the gene-for-gene concept. Annu. Rev. Phytopathol. 9:275–96
Freeman, B.C. and G.A. Beattie. 2008. An Overview of Plant Defenses against Pathogens and Herbivores. The Plant Health Instructor. DOI: 10.1094/PHI-I-2008-0226-01
Heřmanová, V, Bárta, J., Čurn, V. 2006. Antifungální proteiny rostlin, klasifikace, charakteristika, možnosti využití. Chem. Listy 100, 495−500
Matusinsky, P. 2017 Saponiny - obrana rostlin proti houbovým patogenům. Vesmír 96(147) 10: 570-571
Matušinský, P., Zouhar, M., Pavela, R., Nový, P. 2016. Výzkum alternativních způsobů ochrany obilnin proti houbovým patogenům. Obilnářské listy 24(2): 38 - 40
Newman Mari-Anne, Thomas Sundelin, Jon T. Nielsen, Gitte Erbs. 2013. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Frontiers in Plant Science. 139, 1-14. doi: 10.3389/fpls.2013.00139
Pieterse C.M.J., Leon-Reyes A., van der Ent S., a Van Wees S.C.M. (2009): Networking by small-molekule hormones in plant immunity. Nature Chemical Biology 5, 308-316.
Robert-Seilaniantz A., MacLean D., Jikumaru Y., Hill L., Yamaguchi S., Kamiya Y., Jones J.D.G. 2011. The microRNA miR393 re-directs secondary metabolite biosynthesis away from camalexin and towards glucosinolates. Plant J 67, 218–231.
Serrano Mario, Fania Coluccia, Martha Torres, Floriane L’Haridon and Jean-Pierre Métraux. 2014. The cuticle and plant defense to pathogens. Front. Plant Sci., 274, 1-8, doi.org/10.3389/fpls.2014.00274
Wink, M. 1988. Plant breeding: Importance of plant secondary metabolites for protection against pathogens and herbivores. Theoretical and Applied Genetics 75(2):225-233
